Risultati qualitativi e quantitativi del programma di Valutazione Esterna di Qualità VEQ SARS-CoV-2 RNA condotto in Regione Lombardia nel 2021
Qualitative and quantitative performance of SARS-CoV-2 nucleic acid detection tests: results from the 2021 External Quality Assessment in Lombardy

AUTORI

ABSTRACT

Qualitative and quantitative performance of SARS-CoV-2 nucleic acid detection tests: results from the 2021 External Quality Assessment in Lombardy

Introduction: to evaluate the qualitative test performance and inter-assay variations of SARS-CoV-2 nucleic acid detection tests by analysing the results of the External Quality Assessment (EQA) programme carried out in Lombardy in 2021.
Methods: the 2021 EQA for SARS-CoV-2 molecular test programme consisted on testing of 12 exercise (12 samples of cells culture supernatants): 5 were SARS-CoV-2-negative and 7 SARS-CoV-2-positive samples [3 had viral load (VL) >5×103 copies/mL, 4 VL=1-5×103 copies/mL]. Participating laboratories provided qualitative (positive/negative) and quantitative (Cycle threshold, Ct value) results for each molecular test in use. Qualitative test performance was evaluated by positive/negative percent agreement (PPA/NPA); inter-assay variation of quantitative results was evaluated by coefficient of variation (CV).
Results: 79 to 90 laboratories participated by using 199 to 231 systems, returning 2 623 qualitative/quantitative results. PPA ranged between 99.5% and 100%, NPA between 69.9% and 100%. NPA range was 99.1-100% by ruling out the “invalid” results (n=89). CV ranged between 11.6% and 13.5% (samples with VL=1-5×103 copies/mL) and between 10.8% and 14.2% (samples with high VL). The two most used systems gave the following results. System A (275 results) and B (245 results): CV by viral target ranged between 2.4-3.8% and 6.4-9% (samples with VL=1-5×103copies/mL) and between 2.8-4.2% and 7.3-11.9% (samples with high VL) respectively.
Discussion: within 2021 EQA for SARS-CoV-2 molecular test, PPA and NPA were above 99.1%. However, the inter-assay variability among systems was notable and related both to viral load and to viral target detected by the test. This variability, thought limited, needs to be carefully evaluated and continuously monitored within quality assurance programs.

INTRODUZIONE
Alla fine del 2019 è stato identificato per la prima volta nell’uomo un nuovo ceppo di coronavirus denominato SARS-CoV-2 (1), responsabile di una grave sindrome respiratoria acuta denominata COVID-19. In pochi mesi il virus si è diffuso in tutta la popolazione mondiale provocando una pandemia (1,2). Tutti i Paesi nel mondo dall’inizio della pandemia da SARS-CoV-2 hanno concentrato i propri sforzi per controllare e rallentare la diffusione della malattia, per prevenirne il contagio e per individuare la terapia per i pazienti che ne erano affetti. Uno dei nodi cruciali di questi sforzi è stato quello di mettere a punto sistemi diagnostici in grado di distinguere individui con infezione da individui non infetti. Il gold standard per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 rimane ad oggi l’approccio molecolare con rRT-PCR (real-time reverse transcription polymerase chain reaction) (3,4), nonostante nel tempo siano stati sviluppate altre tipologie di test quali i metodi antigenici e sierologici (5-7). L’urgenza di ridurre gli effetti devastanti della pandemia ha determinato da parte dell’industria diagnostica un incredibile e rapidissimo sviluppo di sistemi di diagnostica molecolare rRT-PCR (8). Per monitorare la qualità dei risultati prodotti da questi nuovi sistemi sono stati utilizzati programmi di Verifica Esterna di Qualità (VEQ), che permettono una verifica di terza parte indipendente (9,10). La Regione Lombardia attraverso i programmi VEQ, gestiti ed erogati dal Centro Regionale di Coordinamento della Medicina di Laboratorio (CRC MedLab), monitora la qualità delle prestazioni dei laboratori clinici del territorio (11). Il CRC MedLab dal 2020 ha implementato tre distinti programmi VEQ per la diagnostica di SARS-CoV-2: diagnostica molecolare (RNA SARS-CoV-2), antigenica (Antigene SARS-CoV-2) e sierologica (Sierologia SARS-CoV-2) (12).
Scopo del presente articolo è riportare le prestazioni analitiche e la variabilità inter-saggio dei metodi in uso nei laboratori clinici di Regione Lombardia che hanno partecipato al programma VEQ RNA SARS-CoV-2 nell’anno 2021.

METODI
Modalità di partecipazione al programma
In Italia, la partecipazione ad un programma di VEQ è un requisito per l’accreditamento (13) ed in Regione Lombardia è stata recepita ed applicata con la DGR n° VII/3313/2001 (14) cha ha confermato l’obbligatorietà della partecipazione a programmi VEQ per tutte le prestazioni eseguite in sede.
Prima di poter aderire al programma VEQ RNA SARS-CoV-2 e poter far parte della rete regionale per la diagnostica molecolare COVID-19, tutti i sistemi utilizzati dai laboratori clinici di Regione Lombardia sono stati sottoposti a preventiva verifica dei valori di concordanza con il metodo di riferimento (15,16) condotta presso il laboratorio di riferimento regionale per la sorveglianza virologica dell’influenza e di COVID-19 del Dipartimento di Scienze Biomediche per la Salute, Università degli Studi di Milano (17). In seguito al buon esito della verifica, il laboratorio entra a far parte della rete regionale ed è obbligato a partecipare al programma. Nessuno dei laboratori partecipanti ha dichiarato la contrarietà all’uso da parte del Centro dei risultati dell’anno 2021 del programma VEQ SARS-CoV-2 RNA, in forma anonimizzata ed aggregata, a scopo scientifico per studi e ricerche finalizzate alla tutela della collettività in campo medico, biomedico ed epidemiologico.

Organizzazione del programma 2021 e preparazione del materiale di controllo
Il programma VEQ SARS-CoV-2 RNA 2021 prevedeva 12 esercizi condotti con cadenza mensile durante tutto il 2021.
Il materiale di controllo utilizzato per lo svolgimento degli esercizi VEQ è stato acquisito dal CRC MedLab presso Polymed s.r.l (Barberino Tavarnelle, Firenze) il quale indica il risultato atteso dall’analisi del materiale come: negativo o positivo per SARS-CoV-2. In questo secondo caso inoltre indica se: il campione è positivo ad alta concentrazione virale (viral load, VL) >5×103 copie/mL) o è positivo a bassa concentrazione virale (VL1-5×103 copie/mL). Il materiale di controllo utilizzato era costituito da 1 mL di surnatante ottenuto da colture cellulari coltivate dopo inoculo di tamponi nasofaringei risultati positivi o negativi. Le colture cellulari derivano da cellule epiteliali umane di tumore polmonare (A549 (ATCC® CCL185™).
Ogni laboratorio partecipante alla VEQ ha ricevuto in una provetta il materiale di controllo costituto dal volume di surnatante preventivamente inattivato e liofilizzato ed il corrispondente flacone contenente una soluzione tampone con la quale risospendere il campione dell’esercizio prima di procedere alla determinazione.
Il programma era costituito da 5 campioni
SARS-CoV-2 negativi (esercizi numero 2, 4, 8, 9, 12) e da 7 campioni SARS-CoV-2 positivi; di questi ultimi, 3 erano campioni SARS-CoV-2 positivi ad alta concentrazione (VL >5×103 copie/mL; esercizi 1, 5, 10), e 4 erano campioni SARS-CoV-2 positivi a bassa concentrazione (VL 1-5×103 copie/mL; esercizi 3, 6, 7, 11) (Tabella 1).
Il materiale dei 12 esercizi è stato inviato ai laboratori partecipanti a temperatura controllata (+2/+8°C) e consegnato entro 3 giorni dalla data di spedizione; una volta giunto in laboratorio il materiale di controllo doveva essere conservato a +2/+8°C sino all’analisi. Inoltre, ogni laboratorio doveva dare conferma di avvenuta ricezione del materiale, indicando se questo fosse stato ricevuto in condizioni idonee all’analisi (tra queste, materiale non danneggiato, a temperatura controllata, con volume sufficiente) mediante la compilazione di un modulo online predisposto sul sito web del CRC MedLab.

Validazione dal materiale di controllo
Per validare preliminarmente l’omogeneità dei campioni degli esercizi all’interno del programma, 10 aliquote del medesimo lotto di un esercizio rappresentato da un campione SARS-CoV-2 positivo sono state testate in doppio con test rRT-PCR (18) dal laboratorio del centro di riferimento regionale per la sorveglianza virologica dell’influenza e di COVID-19 del Dipartimento di Scienze Biomediche per la Salute, Università degli studi di Milano.
Per quanto riguarda la stabilità dei campioni in esame, si è confermato quanto dichiarato dal produttore del materiale di controllo per cui il materiale è stabile nella confezione integra sino alla data di scadenza riportata sull’etichetta a +2/+8°C, e per 72 ore dopo ricostituzione, conservando il flacone chiuso a +2/+8°C.

Raccolta dati ed elaborazione
All’interno del programma è stato richiesto l’invio dei risultati delle analisi effettuate entro una scadenza resa nota (in media 10 giorni lavorativi dopo la ricezione del materiale) sul sito web del CRC MedLab. Nel dettaglio, ogni laboratorio partecipante, per ogni esercizio doveva inserire sul sito web le informazioni relative a:
– sistema diagnostico utilizzato, ovvero combinazione del metodo di estrazione degli acidi nucleici (Nome Azienda/Kit) e del metodo di amplificazione (Nome Azienda/Kit) dell’RNA di SARS-CoV-2, specificando il (o i) target genico (o i) virale (o i);
– risultato analitico qualitativo ottenuto tra i seguenti: Positivo/Debole Positivo/Negativo/Dubbio/Invalido;
– risultato analitico quantitativo, espresso come valore di ciclo soglia (Cycle threshold, Ct) per ogni target virale ricercato.
Entro 7 giorni lavorativi dalla scadenza dell’invio dei risultati dell’analisi di ciascun esercizio, è stato pubblicato un elaborato dei risultati. Nel rapporto di elaborazione è stato riportato il numero e la percentuale dei laboratori partecipanti all’esercizio, dei sistemi utilizzati e dei test effettuati. Sono state inoltre indicate le informazioni inerenti a: risultato qualitativo ottenuto e indicazione del target genico di SARS-CoV-2 (Rilevato/non Rilevato); in caso di rilevazione del target virale sono stati riportati i valori mediani tra i valori di Ct inseriti, e il valore minimo e massimo di Ct.

Analisi statistica
Per la valutazione analitica della concordanza dei risultati qualitativi ottenuti dai laboratori per ciascun esercizio all’interno del programma “VEQ RNA
SARS-CoV-2” 2021, sono stati calcolati:
– percentuale di concordanza positiva (positive percent agreement, PPA);
– percentuale di concordanza negativa (negative percent agreement, NPA);
– media, deviazione standard (DS) e coefficiente di variazione (CV%) dei valori di Ct ottenuti per misurare l’imprecisione fra metodi;
Sono stati esclusi dall’analisi i sistemi con ≤3 utilizzatori.
L’analisi statistica per interpretare i risultati ottenuti dai test di omogeneità è stata condotta in accordo alla norma UNI EN ISO 13528, Annex B (18), calcolando e confrontando il CV% storico del programma VEQ RNA SARS-CoV-2.
Per le analisi statistiche, è stato utilizzato il software Bioedit (19) e l’applicativo Excel (Microsoft Office).

RISULTATI
Test di omogeneità
Il test per valutare l’omogeneità dei lotti ha confermato che i campioni utilizzatati nel programma erano omogenei avendo mostrato una media (DS) di 26,84 (0,08152), inferiore al valore soglia di 1,37, determinato dal calcolo 0,3 x spt. Il spt è calcolato dalla media dei risultati ottenuti moltiplicata per il CV storico del programma VEQ (17,01) diviso 100 (18). Il CV% storico è stato calcolato sugli esercizi con esito qualitativo “positivo” degli anni 2020, 2021 e 2022 rispettivamente per gli esercizi 4, 7 e 3.

Risposte ottenute
Il numero di laboratori e di sistemi utilizzati che hanno partecipato alla “VEQ RNA SARS-CoV-2” 2021 è mostrato nella Figura 1. Il numero di laboratori autorizzati allo svolgimento di indagini molecolari per la diagnosi di SARS-CoV-2 in Lombardia è cresciuto nel corso del 2021, passando da 79 laboratori che hanno partecipato all’esercizio 1 a 90 laboratori per l’esercizio 12 (Figura 1), con un incremento percentuale del 14%.
I sistemi per identificare il genoma di SARS-CoV-2 utilizzati dai laboratori all’interno della VEQ erano rappresentati da diverse combinazioni tra kit e strumenti di estrazione degli acidi nucleici e kit e strumenti di amplificazione del genoma di SARS-CoV-2. Nel dettaglio, sono stati utilizzati 70 diversi kit di estrazione combinati a 54 strumenti di estrazione degli acidi nucleici e 61 diversi saggi di rRT-PCR per identificare il genoma di
SARS-CoV-2 mediante 35 strumenti di PCR. In totale, i saggi molecolari per identificare SARS-CoV-2 erano rivolti verso diversi target del genoma virale ed in particolare verso i geni codificanti per il nucleocapside (N), per l’envelope (E), per Spike (S), per l’RNA-polimerasi
RNA-dipendente (RdRp) e per gli Open Reading Frame (ORF) 1 e 8.
Il numero dei sistemi utilizzati è passato da 199 per l’esercizio 1 a 231 per l’esercizio 12 (Figura 1), con un incremento percentuale pari al 16%.
Complessivamente, durante l’esercizio, sono stati
ottenuti 2 737 risultati: 2 623 di questi risultati (95,8% del totale) riportavano anche un risultato quantitativo e cioè il valore di Ct del target genico amplificato.
In totale, il 5,6% (13/231) dei sistemi erano rappresentati da saggi molecolari definiti chiusi, cioè dove l’intervento dell’operatore riguardava solo il caricamento del campione biologico nello strumento analitico in cui la fase di estrazione degli acidi nucleici e l’amplificazione del genoma di SARS-CoV-2 avvenivano senza ulteriore intervento dell’operatore.

I target genici di SARS-CoV-2 analizzati con maggior frequenza sono stati il gene N ed E; in dettaglio, il 31% (n=849) dei risultati era ottenuto mediante reazioni volte alla rilevazione del gene N, il 23,1% (n=633) del gene E, il 18,2% (n=497) di RdRp, il 10,2% (n=277) di ORF-1, il 9,8% (n=269) di ORF-8, il 7,7% (n=212) del gene S.

Percentuale di concordanza positiva, percentuale di concordanza negativa coefficiente di variazione dei valori di Ct ottenuti.
Il valore di PPA ottenuto per gli esercizi costituiti da campioni SARS-CoV-2 positivi è oscillato tra 99,5% (esercizi 1 e 7) e 100% (esercizi 5 e 6); il valore di NPA ottenuto per gli esercizi costituiti da campioni SARS-CoV-2 negativi è oscillato tra il 69,9% (esercizio 4) ed il 100% (esercizi 8 e 9). Analizzando in dettaglio i dati relativi agli esercizi costituiti da campioni SARS-CoV-2 negativi, si è osservato che i bassi valori di NPA erano causati dalla presenza di una rilevante quota di risultati riportati come invalidi (n=89) in particolare per l’esercizio 4 (29,2%) e 12 (10,4%). Escludendo dalla valutazione dei valori di NPA i risultati considerati invalidi, l’intervallo di valori oscillava tra 99,1% (esercizio 4) ed il 100% (esercizi 8 e 9). Il risultato invalido fornito da alcuni sistemi derivava dall’assenza di amplificazione del controllo interno cellulare dei campioni dell’esercizio in esame: il fornitore del materiale aveva indicato come possibile spiegazione che la sospensione di coltura cellulare con cui era stato allestito il campione utilizzato per gli esercizi 4 e 12 fosse troppo diluita.
Considerando tutti i risultati qualitativi forniti indipendentemente dal/i sistema/i utilizzato/i, i valori di media, DS e CV% per esercizio sono riportati nella
Tabella 1; la dispersione dei valori di Ct per esercizio è riportata nella Figura 2.
Complessivamente i valori di CV per gli esercizi rappresentati da campioni SARS-CoV-2 positivi ad alta concentrazione virale sono oscillati tra 10,8% e 14,2% mentre i valori di CV per gli esercizi rappresentati da campioni SARS-CoV-2 positivi a bassa concentrazione virale sono oscillati tra 11,6% e 13,5% (Figura 2).
Per quanto riguarda i sistemi chiusi, i valori di CV ottenuti analizzando gli esercizi rappresentati da campioni SARS-CoV-2 positivi a bassa concentrazione virale oscillavano tra 10,7% e 13,7% e per gli esercizi rappresentati da campioni SARS-CoV-2 positivi ad alta concentrazione virale tra 9,6% e 13%.
Sono stati analizzati i risultati quantitativi per gli esercizi rappresentati da campioni SARS-CoV-2 positivi forniti dai due sistemi maggiormente (19%) utilizzati dai laboratori. In totale il 10,5% (275/2 623) dei risultati quantitativi sono stati forniti da un sistema denominato sistema A in grado di rilevare due target virali A1 e A2 e il 9,3% (245/2 623) sono stati forniti da un sistema denominato sistema B che rilevava i target virali B1 e B2.
Prendendo in considerazione gli esercizi rappresentati da campioni SARS-CoV-2 positivi a bassa concentrazione virale i valori di CV calcolati per esercizio e per gene target oscillavano tra il 2,4 e il 3,8% (B2) e il 6,4 e il 9% (A1) e considerando gli esercizi rappresentati da campioni SARS-CoV-2 positivi ad alta concentrazione virale i valori di CV calcolati per esercizio e per gene target oscillavano tra il 2,1 e il 4,4% (B1) e tra il 7,3 e il 11,9% (A1) (Tabella1).

DISCUSSIONE
L’emergenza di SARS-CoV-2 e la conseguente pandemia dichiarata dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) a marzo 2020 ha portato sfide imprevedibili e senza precedenti per la sanità pubblica globale (1,2). L’urgenza di contrastare la diffusione della pandemia ha determinato da parte dell’industria diagnostica un incredibile e rapidissimo sviluppo di sistemi di diagnostica molecolare (in particolare di saggi di rRT-PCR, riconosciuti come test diagnostici di riferimento) per rispondere alla sempre crescente richiesta di riconoscere la presenza dell’infezione sia nel soggetto asintomatico sia nel paziente con COVID-19 (3,4). Per monitorare la qualità dei risultati prodotti da questi saggi molecolari che sono stati largamente utilizzati a laboratori clinici del territorio per contrastare la pandemia, la Regione Lombardia ha implementato programmi di VEQ ad hoc, gestiti ed erogati dal CRC MedLab (9). Il programma “VEQ RNA
SARS-CoV-2” è stato uno strumento indiretto per la verifica della qualità delle prestazioni dei laboratori clinici rese agli utenti finali. Tale programma, costituito da 12 esercizi condotti mensilmente è stato svolto da un numero di laboratori autorizzati e di sistemi utilizzati che ha avuto un incremento del 14% e del 16%, rispettivamente, durante l’anno 2021, tanto che 90 laboratori hanno partecipato alla conduzione dell’ultimo esercizio del 2021 utilizzando 231 diversi sistemi diagnostici.
La numerosità dei sistemi diagnostici molecolari e l’eterogeneità dei target del genoma di SARS-CoV-2 identificati rappresentano elementi da considerare nella valutazione della variabilità dei risultati intra- e
inter-laboratorio e ancora di più nel confronto dei risultati (20,21). Questo appare rilevante se si considera che i saggi molecolari possono fornire – oltre al risultato qualitativo (presenza/assenza del target genico) – risultati quantitativi o semi-quantitativi quali il valore di Ct per target genico amplificato, considerato “proxy” della concentrazione di SARS-CoV-2 nel campione in esame e della trasmissibilità dell’infezione (4). Il valore di Ct è inversamente proporzionale alla concentrazione di gene target nel campione e può essere influenzato da diverse variabili, inclusa la qualità del campione, la qualità del metodo di estrazione degli acidi nucleici e la scelta dei primers (8). Ad oggi, i target virali N, E, S, ORF e RdRp sono stati quelli maggiormente impiegati per la diagnostica molecolare di SARS-CoV-2 (8,22,23) e l’OMS ha pubblicato diversi protocolli di saggi RT-PCR che considerano target genici di SARS-CoV-2 differenti (8) cosicché può risultare difficile il confronto dei valori di Ct.
Durante il programma di VEQ, quasi tutte le risposte (95,8%) ottenute dai laboratori riportavano anche il valore di Ct, che nel 31% dei casi si riferiva all’amplificazione del gene N e nel 23,1% del gene E, che quindi sono risultati i due target virali maggiormente utilizzati, analogamente a quanto osservato in altri Paesi (10,15,16,24). Infatti, è stato dimostrato che i metodi molecolari volti alla identificazione e quantificazione dei target N, E, e RdRP sono maggiormente sensibili e clinicamente accurati e quindi maggiormente utilizzati dai laboratori di tutto il mondo (10,15,16).
Durante il programma, i valori di PPA e NPA ottenuti tra i laboratori autorizzati sono stati soddisfacenti. In effetti, il valore di PPA è oscillato tra il 99,5% e il 100% e il valore di NPA tra il 69,9% e il 100%. Analizzando in dettaglio i risultati degli esercizi in cui è stato ottenuto il minor valore di NPA, è stato osservato che per questi campioni, una rilevante (29,2%) quota di laboratori aveva riportato quale invalido il risultato ottenuto a causa della qualità non ottimale del campione in esame, probabilmente causata da un’eccessiva diluzione della sospensione di coltura cellulare con conseguente fallimento della rilevazione del materiale umano come controllo di avvenuta reazione. Ciò sottolinea che tra le sorgenti di errore nella diagnostica COVID-19, la fase pre-analitica (dipendente dalla qualità del campione stesso, dalla conservazione/trasporto e dal trattamento pre-analitico del campione) influenza significativamente il risultato atteso (25). Altre sorgenti di errore possono essere individuate nella fase analitica, in particolar modo durante l’estrazione e l’amplificazione degli acidi nucleici, e possono essere contenute mediante l’implementazione della automazione e di sistemi analitici chiusi (25), che hanno rappresentato il 5,6% dei sistemi utilizzati nel programma qui analizzato.
È stato misurato il valore di imprecisione fra i diversi metodi mediante il calcolo CV% dei valori di Ct. Sostanzialmente si è osservata una tendenza ad una minor variabilità tra tutti i risultati quantitativi laddove il campione avesse una concentrazione virale maggiore, come osservato anche in un altro studio (26); infatti i valori di CV% per gli esercizi rappresentati da campioni
SARS-CoV-2 positivi ad alta concentrazione virale sono oscillati tra 10,8% e 14,2% ed i valori di CV% per gli esercizi rappresentati da campioni SARS-CoV-2 positivi a bassa concentrazione virale sono oscillati tra 11,6% e 13,5%. Questi valori di imprecisione sono risultati inferiori a quelli osservati in studi in cui i valori di CV% oscillavano tra il 12,8% e il 23% (27,28). Quindi, il CV% medio è risultato pari a 12,4%; su una scala di risultati quantitativi espressi in Ct che va da 0 a 42, tale variazione rappresenta differenze di risultato logaritmiche nell’ordine di +/- 5 Ct: questo dato sembra molto importante soprattutto per risultati vicini al valore decisionale di positività.
È interessante notare come l’imprecisione della misura del valore di Ct diminuiva analizzando i dati prodotti dai due sistemi maggiormente utilizzati dai laboratori autorizzati in Regione Lombardia e analizzando gli stessi geni virali target; infatti, considerando gli esercizi rappresentati da campioni SARS-CoV-2 positivi a bassa concentrazione virale, i valori di CV oscillavano tra 2,4% e 3,8% e 6,4% e 9% e per gli esercizi alta concentrazione virale tra 2,1% e 4,4% e 7,3% e 11,9%. Il confronto dei CV% totali con quelli dei due sistemi maggiormente considerati suggerisce che la precisione nel quantificare il genoma di SARS-CoV-2 aumenterebbe utilizzando saggi quantitativi di rRT-PCR standardizzati; ciononostante, rimane ancora controverso il correlare il valore di carica virale con l’infettività e la durata della clearance virale, soprattutto in mancanza di precisi modelli statistici. In ultimo, i dati di dispersione dei valori di Ct, potrebbero suggerire l’utilità per il paziente in follow-up di eseguire l’analisi sempre nel medesimo laboratorio.
Il principale punto di forza di questo studio è che ha permesso di analizzare statisticamente la distribuzione dei valori di Ct di oltre 2600 test molecolari ottenuti attraverso la conduzione di esercizi VEQ su campioni omogenei e stabili, quindi con controllata variabilità pre-analitica. La valutazione delle prestazioni analitiche dei laboratori in Lombardia nel 2021 all’interno delle attività del programma VEQ diagnostica molecolare
SARS-CoV-2 RNA è risultato di estremo valore per la pratica clinica e per la sanità pubblica (9,10,29-31). Infatti, questo programma VEQ ha permesso di controllare la qualità dell’attività diagnostica di un numero crescente nel tempo di laboratori e di sistemi in uso, di osservare elevate percentuali di PPA e di NPA e di stimare una accettabile variabilità tra meotdi, dipendente principalmente dal target e dalla concentrazione virale nel campione.
Il maggior limite dello studio è che la concentrazione di SARS-CoV-2 ottenuta al termine dell’estrazione degli acidi nucleici dei campioni rappresentati dagli esercizi in esame così come il volume di input per il saggio di amplificazione del gene target potrebbero essere stati diversi tra i vari sistemi, sia manuali che automatici, ma dipendente dalle indicazioni del produttore del saggio analitico stesso.
In conclusione, alla luce delle evidenze fornite dall’analisi dei risultati ottenuti, appare necessario continuare a implementare programmi di VEQ per la diagnostica molecolare di SARS-CoV-2 per fornire ai laboratori chiare indicazioni sulla qualità dei sistemi diagnostici utilizzati e sull’eventuale necessità di sostituirli, per promuovere l’uniformità dei risultati ottenuti in laboratori differenti anche ipotizzando la definizione di limiti di accettabilità per i valori di Ct, per sostenere l’adozione di metodi con tracciabilità metrologica.

CONFLITTO DI INTERESSE
Nessuno.

Ringraziamenti
Gli autori ringraziano le instancabili donne e uomini che dalle trincee dei laboratori hanno contribuito in modo rilevante alla lotta contro SARS-CoV-2.

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