Riscontro occasionale di varianti emoglobiniche nel corso della determinazione di HbA1c in elettroforesi capillare: Hb Bleuland e Hb La Desirade
Incidental detection of hemoglobin variants during the determination of HbA1c in capillary electrophoresis: Hb Bleuland and Hb La Desirade

AUTORI

ABSTRACT

Incidental detection of hemoglobin variants during the determination of HbA1c in capillary electrophoresis: Hb Bleuland and Hb La Desirade

Haemoglobin A1c (HbA1c) is a test routinely used to monitor long-term glycemic control in diabetic patients as well as for the diagnosis of diabetes. Capillary electrophoresis (CE) is an accurate and valid method to separate and quantify HbA1c and to detect HbF, HbA2 and haemoglobin variants. The purpose of this study is to report three Hb variants accidentally observed during HbA1c testing. HbA1c tests had been carried out using Capillarys 3 TERA “HbA1c kit” (Sebia, France) in the Hub Laboratory of AUSL Romagna. To screen for Hb variants interfering with HbA1c determination, Capillarys 3 TERA “Hemoglobine kit” was used. Molecular analysis of globin genes was performed by Next Generation Sequencing (NGS) technology. During routine HbA1c testing, we observed three cases of interference with HbA1c assay that led to the suspicion of Hb variants that subsequently were not detectable by the specific “Hemoglobine kit” assay. NGS identified a woman with Hb La Desirade (β 129(H7) Ala–>Val), a man with Hb Bleuland (α 108(G15) Thr–>Asn). Genetic analysis for the third case is still in progress. The two identified Hb variants are clinically asymptomatic; however, if they co-exist with other Hb variants or thalassemia, they could cause clinical symptoms. HbA1c testing performed by CE is an essential part of routine management of diabetes and in addition has proven to be an effective and powerful method to detect rare or silent Hb variants. We suggest laboratory personnel to be aware of the limitations of their method with respect to the identification of Hb variants.

CASI CLINICI
L’emoglobina glicata (HbA1c) è un marcatore biochimico utilizzato nella diagnosi e nel monitoraggio del diabete. Per la sua determinazione vengono utilizzati diversi metodi analitici che possono essere raggruppati, sulla base del principio utilizzato, nelle seguenti categorie: immunochimici, in cromatografia liquida a scambio ionico o di affinità e basati sulla mobilità elettroforetica come l’elettroforesi capillare (CE) (1).
L’Unità Operativa di Patologia Clinica del AUSL della Romagna è organizzata secondo un modello Hub e Spoke, in una rete di 8 laboratori e fornisce attività diagnostica ad un’area di circa 1200000 abitanti. Nel laboratorio di riferimento (Hub) (esterno alle strutture ospedaliere)
è centralizzata la determinazione di HbA1c: ogni anno vengono eseguite circa 200 000 determinazioni di HbA1c per diagnosi o monitoraggio dei pazienti diabetici con tecnologia CE (Capillarys 3 Tera con HbA1c kit – Sebia, Lisses, Francia). In particolare, nel periodo luglio 2021–giugno 2022, il riscontro occasionale di alcune varianti emoglobiniche (Hb) interferenti con la misurazione di HbA1c ha portato all’approfondimento diagnostico in tre casi selezionati.
Nella Figura 1A è riportato il tracciato elettroforetico relativo ad un paziente diabetico di 55 anni originario del Bangladesh; l’elettroferogramma si è rivelato atipico per la presenza di uno sdoppiamento dei picchi relativi alle frazioni dell’emoglobina A0 (HbA0) e dell’emoglobina A2 (HbA2), condizione che lasciava presumere la presenza di una variante alfa. La frazione HbA1c è risultata non quantificabile.
Il secondo caso riguarda una donna gravida di 30 anni originaria del Burkina Faso. Il tracciato elettroforetico (Figura 1B) si è rivelato anomalo tanto per la presenza di due picchi relativi alla frazione HbA0 quanto per la mancata quantificazione di HbA2 e di HbA1c. Nella Figura 1C è riportato il tracciato del terzo caso relativo ad una donna di 56 anni originaria della Grecia che ha eseguito la determinazione di HbA1c come approfondimento in seguito ad un precedente riscontro di valori di glicemia al limite di norma. Il tracciato elettroforetico si è rivelato atipico per una lieve interferenza in corrispondenza del picco HbA0, e per la mancata quantificazione di HbA1c; il picco relativo all’ HbA2 non ha presentato alcuna anomalia. In tutti e tre i casi descritti la presenza di un tracciato elettroforetico anomalo e l’impossibilità di quantificare l’HbA1c ha suggerito la presenza di una variante Hb; pertanto, il laboratorio ha allertato i soggetti e i relativi medici curanti rispetto alla possibile presenza di una variante Hb in grado di interferire nella determinazione di HbA1c. Nel caso della donna gravida è stato anche suggerito un approfondimento diagnostico per diabete gestazionale.
Nel medesimo settore analitico del laboratorio vengono eseguite anche le determinazioni di HbA2, HbF e varianti Hb, utilizzando gli stessi strumenti (Capillarys 3 Tera) dotati del kit specifico per la ricerca di emoglobine patologiche (Capi3 Hemoglobine). Pertanto, si è ritenuto opportuno approfondire i tre casi studiando le frazioni emoglobiniche nello stesso prelievo di sangue già utilizzato per la misura di HbA1c. A completamento del quadro laboratoristico e per una corretta interpretazione dei dati, sono stati effettuati l’esame emocromocitometrico (Sysmex XN, Sysmex, Germania) e gli esami per lo studio dell’assetto marziale (Cobas, c702, Roche Diagnostics, Germania). Il kit specifico per lo studio dell’assetto emoglobinico non ha evidenziato alcuna anomalia nei tracciati elettroforetici dei tre casi, mentre la misura di HbA2 (rispettivamente 2,6%, 3,2% e 3,1%) è risultata all’interno dell’intervallo di riferimento (2,2-3,5) (Figura 1D, E, F). I risultati dell’emocromo del primo paziente hanno mostrato anemia, microcitosi e ipocromia lievi rispettivamente con valori di Hb 123 g/L
(i.r. 135-170), volume corpuscolare medio (MCV) 79,7 fL (i.r. 80- 95) e contenuto emoglobinico medio (MCH) 25,2 pg/mL (i.r. 27-32) con un normale assetto marziale. Le altre due pazienti presentavano normali indici eritrocitari e assetto marziale. La persistenza del dubbio rispetto alla presenza di varianti Hb, anche in seguito al mancato riscontro di esse con l’utilizzo di uno specifico kit diagnostico, ha posto le basi per un approfondimento molecolare. L’analisi molecolare eseguita utilizzando il sequenziamento con metodica Next Generation Sequencing (NGS) e l’utilizzo del kit Devyser Thalassemia (2), presso il Laboratorio di Genetica Medica dell’Istituto Giannina Gaslini di Genova ha evidenziato: nel primo caso la variante alfa Hb Bleuland [α108(G15) Thr→Asn], nel secondo caso la variante beta Hb La Desirade [β129(H7) Ala→Val], mentre per il terzo caso i risultati della caratterizzazione molecolare sono tuttora in corso.
DISCUSSIONE
Il diabete mellito è un disordine metabolico con eziologia eterogena, la cui prevalenza è in continuo incremento come riportato dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) (3). L’HbA1c rappresenta un parametro di laboratorio fondamentale per monitorare il diabete e più recentemente adottato anche come criterio diagnostico (HbA1c >48 mmol/mol, HbA1c >6,5%) (4). Come tutti i parametri di laboratorio anche l’HbA1c è soggetta a interferenze che possono impedire la sua misura o renderla inaccurata. La presenza di una variante Hb può determinare un’interferenza sulla misura di HbA1c, che può essere di tipo strettamente analitico o, più in generale, di tipo biologico/preanalitico (1). La CE per l’analisi di HbA1c rappresenta una tecnica separativa che oltre a misurare la frazione HbA1c, rende disponibile il livello di HbA2 e può evidenziare anomalie presuntive di incremento di HbF o presenza di varianti Hb. Secondo quanto riportato dal manuale del produttore e in accordo ai dati descritti in letteratura, incrementi <23% di HbF o la presenza in eterozigosi di una delle più frequenti varianti Hb (HbS HbE, HbC, e HbD), pur evidenziando un atipico profilo non interferiscono con la misura di HbA1c (5,6).
La maggior parte delle varianti Hb che interferiscono con la misurazione di HbA1c sono rare o clinicamente asintomatiche; tuttavia, è opportuno non sottovalutare il loro rischio clinico specialmente se queste coesistono con altre varianti o con tratti talassemici (7-9).
L’assetto Hb del primo paziente (HbA2 2,8%; HbF 0,3%) ed il suo fenotipo ematologico (lieve anemia, microcitosi e ipocromia, senza alterazioni nel bilancio marziale) potevano suggerire un caso di alfa talassemia lieve.
In effetti l’analisi molecolare della variante intercettata durante la misurazione di HbA1c ha evidenziato la presenza di Hb Bleuland, una variante del gene α-globinico associata ad un fenotipo alfa talassemico lieve. Hb Bleuland deriva dalla sostituzione dell’amminoacido treonina con l’amminoacido asparagina (Thr→Asn) in posizione 108 del gene α2-globinico (10). L’amminoacido treonina, situato nell’elica G della catena α della globina, è normalmente coinvolto sia nel legame covalente tra le catene α1β1 che nell’interazione delle catene α con la proteina stabilizzante le globine α [α Hemoglobin (Hb) Stabilizing Protein, AHSP] (11) e la sua sostituzione con asparagina rende la catena mutata meno adatta alla cooperazione tetramerica. Sebbene tale variante nella maggior parte dei casi sia clinicamente silente, una debole o assente interazione delle catene alfa con AHSP, in combinazione con un allele α0-thal o con mutazioni nei siti di poliadenilazione del gene α2, comporterebbe implicazioni cliniche di maggiore entità (10,11).
Nel secondo caso, in fase di esami pre-concezionali, è stato possibile sospettare la presenza di una variante emoglobinica successivamente caratterizzata come Hb La Desirade. Tale variante è determinata dalla sostituzione dell’amminoacido alanina con l’amminoacido valina (Ala→Val) in posizione 129 del gene β globinico. La maggior parte dei casi di Hb La Desirade descritti in letteratura sono clinicamente asintomatici e senza alcuna evidenza di anemia. Tuttavia, recenti studi hanno messo in evidenza il rischio di sintomi clinici quando Hb La Desirade risulta associata a tratti talassemici o ad altre varianti; in particolare, è stato riportato nei casi di eterozigosi composta Hb La Desirade/HbS un incremento della frazione HbS di circa il 10% rispetto alla sola eterozigosi HbS, rendendo così i dati di laboratorio di difficile interpretazione (12). È stato anche descritto il caso di un soggetto tailandese con eterozigosi composta per Hb Louisville [β42(CD1)Phe→Leu] e Hb La Desirade che ha mostrato severa anemia con basse saturazione e pressione parziale dell’ossigeno (13).
Si ritiene che sia importante segnalare la presenza di varianti Hb riscontrate occasionalmente durante la misura di HbA1c. Essendo il laboratorio dotato anche del kit Capi-3 Hemoglobine, specifico per lo studio dell’assetto Hb, siamo stati in grado di approfondire tutti i casi sospetti. La discrepanza tra i risultati dei due kit nella capacità di evidenziare le varianti Hb ha portato ad un confronto con la ditta fornitrice, la quale ha evidenziato una differenza nella composizione dei due tamponi utilizzati (HbA1c ed Hemoglobine) che potrebbe spiegare la diversa capacità discriminativa. La presenza dell’acido dicarbossifenilboronico nel tampone del reagente per HbA1c potrebbe conferire al metodo un maggior potere discriminativo rispetto al tampone impiegato nel kit Hemoglobine, che risulta esserne privo. Il potenziale dell’acido borico nella separazione di HbA1c da Hb non glicata è già noto da tempo poiché rappresenta il principio impiegato da altre metodiche quali la cromatografia di affinità (14). Risultati simili ai nostri sono stati descritti anche da Peteeters et al. per la variante rara Hb Melusine [α144(GH2) Pro→Ser]; tale variante infatti è stata intercettata mediante CE utilizzando un kit per HbA1c ma non con il kit dedicato allo studio delle emoglobinopatie (15). La comparazione di differenti metodi di analisi per HbA1c ha evidenziato che CE è il metodo con le migliori prestazioni, sia nell’identificazione delle varianti rare sia nella corretta quantificazione di HbA1c (16,17).
In conclusione, riteniamo che la determinazione di HbA1c eseguita mediante CE sia essenziale tanto come ausilio nelle nuove diagnosi di diabete quanto per la gestione cronica dei pazienti diabetici; è altresì dimostrato come tale metodica rappresenti un mezzo efficace e specifico per rilevare varianti Hb rare o silenti, motivo per cui il professionista di laboratorio deve essere consapevole della possibile interferenza di queste varianti sulla misurazione di HbA1c. Per tali ragioni un’adeguata gestione e refertazione di queste alterazioni al fine di un corretto inquadramento del paziente risulta clinicamente utile. Nonostante la maggior parte delle varianti Hb rare rilevate accidentalmente siano clinicamente asintomatiche, sarebbe opportuno non sottovalutarne il potenziale rischio se combinate con altre varianti o tratti talassemici; a tale scopo può aiutare un percorso diagnostico di secondo livello per lo studio dei difetti dei geni globinici. Il personale di laboratorio dovrebbe adottare un atteggiamento critico nei confronti del metodo impiegato così da riconoscerne potenzialità e limiti oltre che valutare, ove opportuno e possibile, un confronto con una differente metodologia.
CONFLITTO DI INTERESSI

Nessuno.

BIBLIOGRAFIA

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